اصول ارزیابی پست لاروهای میگو قبل از ذخیره سازی ضرورت استفاده از آزمایشات استرس و نمونه‌برداری PCR برای ارزیابی کیفیت پست لاروهای میگو
نویسنده: Darryl E. Jory, Ph.D
ذخیره‌سازی استخرهای پرورش میگو با بهترین پست لاروهای با کیفیت برای موفقیت یک مزرعه میگو امری بسیار حیاتی است . برای ارزیابی کیفیت PL از معیارهای متعدد شناخته‌شده ای استفاده می‌شود، که از جمله آنها می توان به:
- مبدا و اعتبار مرکز تکثیر که پست لاروها از آن خریداری شده
- ارزیابی چشمی پست لاروهای خریداری شده
- انجام تست‌های استرس
- و آزمایشات مختلفی که برای تشخیص وجود عوامل بیماری‌زا در پست لاروها به کار می رود ، اشاره کرد.
استفاده دقیق از معیارهای ارزیابی کیفیت PL در سنجش و انتخاب آنها برای ذخیره‌سازی و همچنین داشتن یک دستورالعمل اجرایی دقیق برای استفاده از بهترین پست لاروهای با کیفیت ، از فاکتورهای بسیار مهم و پایه ای در زنجیره تولید میگوی پرورشی هستند و تأثیر قابل ملاحظه ای بر تولید و سودآوری یک مزرعه میگو خواهند داشت.
به حداقل رساندن استرس در طول فرایند تحویل پست لاروها از مرکز تکثیر، حمل و نقل به مزرعه و روند سازگاری و ذخیره سازی آنها ، نیز از اولویت بالایی برخوردار است، زیرا پست لاروهای تحت استرس هنگامی که به محیط پرورشی معرفی می‌شوند شانس زنده ماندن کمتری داشته و اگر زنده بمانند وازده محسوب شده و در نتیجه باعث کاهش بقا، رشد، تولید و سودآوری تولیدکننده می شوند.
ارزیابی کیفیت پست لارو
از معیار های مهم متعددی جهت ارزیابی کیفیت پست لاروها قبل از ذخیره سازی آنها در مزرعه استفاده می‌شود. یکی از این موارد، بررسی میکروسکوپی لاروها قبل از فرایند معرفی و سازگاری آنها از نظر شاخص:
پر بودن روده،
حضور موکوس و کثافات بر روی پرزها،
کدورت پاهای شنا و عضله دم
و بدشکلی‌های مورفولوژیکی است.
میگوهای سالم بایستی دارای روستروم کامل و توسعه یافته، خوش فرم و بدون خمیدگی بدن باشند. دم آنها خمیده یا دارای انقباض عضلانی نباشد. چشم‌ها و پایه های چشم تکامل یافته و خوش فرم باشند. پاهای شنا خوش فرم و کامل باشند و به طور کلی از نظر فیزیکی میگوها ظاهر خوبی داشته باشند. در طول سازگاری، معیارهای دیگری که باید بررسی شوند شامل ارزیابی فعالیت شنای پست لاروها، هرگونه رفتار شنای نامنظم، کدورت عضلات دم، وجود پوست‌اندازی، شاخص پر بودن روده، تلفات و فراوانی کانی بالیسم است.
معیارهای زیر برای ارزیابی کیفیت PL مدتها است که در صنعت مورد استفاده قرار می‌گیرند:
سن، اندازه و اختلاف سایز پست لاروها، شاخص وضعیت (وزن)، میزان تحرک ، درصد و درجه بدشکلی‌های مورفولوژیکی، حضور/ عدم حضور عوامل بیماری‌زا (ویروس‌ها، باکتری‌ها، قارچ‌ها، تک‌یاخته‌ها و میکروسپوریدین‌ها)، تمیز بودن کاراپاس (عاری بودن از ارگانیسم های مزاحم)، رنگ و الگوی کروماتوفورها(رنگدانه ها)، ساختار عضلات (شکل و رنگ)، مقاومت در برابر استرس های محیطی، قرار گرفتن قبلی در معرض مواد شیمیایی یا محرک های ایمنی، سابقه تغذیه، منشأ بیولوژیکی مولدین (وحشی یا پرورش‌یافته در هچری) و منشأ مولدین استفاده شده .
انجام آزمایشات استرس جهت ارزیابی مقاومت پست لاروها
قدرت تحمل یا «مقاومت» PL خریداری شده از مراکز تکثیر مختلف و/ یا بچ های مختلف یک مرکز می‌تواند به طور قابل توجهی متفاوت باشند و برنامه سازگاری را می‌توان با «مقاومت» PL تنظیم کرد، به طوری که در آن پست لاروهای قوی‌تر را می‌توان سریع تر از ضعیف‌ترها سازگاری داده و به مزرعه معرفی کرد.
آزمایش‌های استرس مختلفی برای به چالش کشیدن بچ های تولیدی پست لاروها و تعیین میزان مقاومت آنها(برای تصمیم‌گیری در مورد یک برنامه سازگاری مناسب) استفاده شده است. این آزمایش‌ها یا چالش‌ها معمولاً شامل قرار دادن ۱۰۰ تا ۲۰۰ پست لارو در معرض شوک حرارتی، اسمزی(شوری) و/یا شیمیایی (معمولاً فرمالین) به مدت ۱ تا ۴ ساعت و «شمارش بازماندگان» است.
یکی از چالش‌های پرکاربرد، استفاده از روش استاندارد آزمایش استرس است که در آن نمونه‌ای از PL را در یک ظرف یا مخزن قرار می دهند و شوری و دمای آب را به طور همزمان به مدت چهار ساعت کاهش داده و آنها را به ترتیب به ۲۰ ppt و ۱۰ درجه سانتیگراد کاهش می دهند (آزمایشی که کمتر از چهار ساعت طول بکشد، عموماً به طور مناسبی تلفات طولانی مدت PL را توجیه نمی‌کند). نوعی دیگر از این آزمایشات، استفاده از محلول فرمالین به میزان ۱۰۰ تا ppm ۱۵۰ است که در آن زنده ماندن ۸۰ تا ۱۰۰ درصد از پست لاروهای آزمایشی نشان دهنده کیفیت بالای PL است، در حالی که زنده ماندن ۶۰ تا ۷۹ درصد قابل قبول در نظر گرفته می‌شود و نرخ زنده ماندن زیر ۶۰ درصد باعث رد کردن بچ تولیدی یا نگه داشتن آن در هچری برای چند روز دیگر جهت بهبود مقاومت و کیفیت آنها می شود.
نوع دیگری از ارزیابی کیفیت PL آزمایش کیفیت یک یا دو پارامتری (دما و/یا شوری) است که در آن ۱۰۰ تا ۲۰۰ پست لارو که به طور تصادفی جمع‌آوری شده‌اند، در سطلی حاوی ۱۰ تا ۱۵ لیتر آب با دمای ۲۲ درجه سانتیگراد و ppt ۵ شوری (آزمایش دو پارامتری) یا در دمای محیط هچری و ۰ تا ppt ۱ قرار می‌گیرند. پست لاروها به مدت یک ساعت در این شرایط نگهداری می‌شوند و بازماندگان (پست لاروهایی که به طور طبیعی شنا می‌کنند و پاسخ می‌دهند) شمارش می‌شوند. اگر میزان زنده ماندن ۸۰ درصد یا بیشتر باشد، جمعیت از آزمایش قبول شده است.
نمونه‌برداری پست لاروها جهت انجام آزمایشات PCR
صنعت پرورش میگو در سطح جهان به مدت سه دهه تحت تأثیر شیوع دوره‌ای بیماری‌های مختلف عمده قرار گرفته که به طور قابل توجهی بر صنایع در چندین کشور( از جمله کشورهای برتر تولیدکننده میگو) تأثیر گذاشته است. یکی از دستورالعمل های مهم اجرایی( به عنوان بخشی از یک استراتژی کلی تولید ایمن زیستی) ذخیره سازی پست لاروهای میگوی عاری از عوامل بیماری‌زا است. آزمایش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به ابزاری اصلی برای ارزیابی وضعیت سلامت PL قبل از خروج از مراکز تکثیر تبدیل شده است.
بر این اساس ، رعایت پروتکل مناسب نمونه‌برداری برای پشتیبانی از اعتبار آماری آزمایشات ارزیابی کیفی PL امری ضروری است. اگر هدف تعیین میزان شیوع ییماری یا شدت آن در یک جمعیت خاص باشد، بایستی اقدام به نمونه برداری تصادفی از جمعیت به ظاهر سالم نمود. اما اگر هدف برنامه نمونه‌برداری ، تأیید وجود یک عامل بیماریزای هدفمند باشد، بایستی اقدام به نمونه‌برداری هدفمند از پست لاروهای بیمار، ضعیف یا در حال مرگ نمود. در برنامه نمونه‌برداری تصادفی، حداقل تعداد نمونه جمع‌آوری‌شده میگو تابعی از اندازه جمعیت است.
نمونه برداری با سطح اطمینان ۹۵ درصد و درصد شیوع ۲ درصد به عنوان استاندارد نمونه برداری PCR در بسیاری از مراکز تکثیر پذیرفته شده است. بنابراین، بر اساس اصول آماری، برای هر مخزن یا حوضچه لاروی حاوی بیش از ۱۰۰۰۰۰ لارو ، حداقل ۱۵۰ لارو باید از هر مخزن یا حوضچه جمع‌آوری شود. هنگام نمونه‌برداری از لاروها برای تجزیه و تحلیل PCR، ممکن است ۱۵۰ لارو را با هم مخلوط و له کرده و به عنوان یک نمونه واحد آن را آزمایش کرد. البته بسته به نوع تجهیزات PCR مورد استفاده، ممکن است لازم باشد ۱۵۰ لارو را به یک یا چند زیرنمونه ۳۰ عددی تقسیم کرده و هر 30 لارو را با هم مخلوط(pool) نمود. در این حالت، بایستی مطمئن شد که همه ۵ زیرنمونه بصورت مجزا آزمایش شده باشند.
این تعداد نمونه ۱۵۰ لارو زنده از هر مخزن، حداقل اندازه نمونه برای غربالگری لاروها از نظر بسیاری از بیماری‌ها می باشد. لارو زنده باید با استفاده از آزمایش PCR مناسب در مراحل زوآ، مایسیس و مراحل اولیه پست لارو آزمایش شود، اما به طور کلی نتایج قابل اعتمادتر را می‌توان در مراحل پست لارو بزرگتر به دست آورد.
برخی از نکات مهم که هنگام تفسیر نتایج PCR باید در نظر گرفته شوند عبارتند از:
1) PCR حضور قطعاتی از DNA ویروسی را تشخیص می‌دهد ( نه لزوماً ویریون‌های سالم و زنده را) . بنابراین، نتیجه مثبت PCR دلیلی بر حضور عامل بیماریزای زنده نمی باشد.
2) نتایج مثبت PCR با برخی از ارگانیسم‌های خاص ممکن است به دلیل آلودگی متقاطع و غیرفعال آنها توسط قطعات ویروسی باشد. به عنوان مثال آلودگی متقاطع ناشی از تغذیه میگو با غذای زنده نظیر نرم‌تنان فیلترکننده غذا، ضایعات ماهی یا حشرات و غیره.
3) ممکن است سویه‌های مختلفی از پاتوژن مورد نظر وجود داشته باشد که همه آنها به یک پرایمر یکسان (موجود ما) واکنش نشان ندهند.
بنابراین ، واکنش PCR مثبت در نمونه ها می‌تواند ناشی از حضور ویروس کامل و سالم (مثبت واقعی)، حضور قطعات DNA مکمل پرایمر و/یا آلودگی متقاطع نمونه ها رخ دهد. نتیجه منفی PCR نیز می‌تواند ناشی از عدم وجود DNA ویروسی (منفی واقعی)، تخریب اسید نوکلئیک، وجود مهارکننده‌های PCR و/یا تکنیک نمونه‌برداری ضعیف باشد.
به دلیل وجود عوامل مختلف ایجاد خطا در آزمایشات ، برخی از تولیدکنندگان می‌توانند نتایج PCR را با سایر روش‌های تشخیصی مانند بافت‌شناسی یا هیبریداسیون درجا (in situ hybridization) تأیید و تکمیل نمایند.
بحث و جمع بندی
ذخیره‌سازی پست لاروهای با بالاترین کیفیت ممکن، سالم و عاری از عوامل بیماری‌زا، برای موفقیت هر مزرعه میگو بسیار مهم و حیاتی است. تعدادی معیار شناخته‌شده برای ارزیابی کیفیت PL وجود دارد که از مهم ترین آنها می توان به مبدا و اعتبار مرکز تکثیر تامین کننده پست لارو، ارزیابی چشمی، آزمایشات استرس و آزمایشات مختلف برای تشخیص وجود عوامل بیماری‌زا اشاره کرد.
انتقال پست لاروها از مراکز تکثیر به سیستم های پرورشی باز مانند مخازن و استخرها، که در آنها شرایط آب می‌تواند به طور مداوم یا غیرقابل پیش‌بینی تغییر کند (روز/ شب، فصول خشک/ بارانی در طول چرخه تولید) می‌تواند یک تجربه آسیب‌زا و مخرب برای PLها باشد، مگر اینکه این انتقال تدریجی بوده و استرس با پیروی از رویه‌های مناسب سازگاری به حداقل برسد.
استفاده دقیق از معیارهای ارزیابی کیفیت PL در سنجش و انتخاب PLها برای ذخیره‌سازی و همچنین داشتن یک دستورالعمل اجرایی دقیق برای استفاده از بهترین پست لاروهای با کیفیت موجود و در دسترس، از فاکتورهای بسیار مهم و پایه ای در زنجیره تولید میگوی پرورشی هستند و تأثیر قابل ملاحظه ای بر تولید و سودآوری یک مزرعه میگو خواهند داشت و باید به عنوان رویه‌های استاندارد در نظر گرفته شوند.
