اعتماد 24 ساعته Businext سرویس دهنده!

تهدید پنهان بیماری EHPدر پرورش میگو

۲۷ اسفند ۱۴۰۳ March 17, 2025
اخبار جهان, اخبار صنعت آبزیان, مقالات
0دیدگاه ها
تهدید پنهان بیماری EHPدر پرورش میگو

 

چکیده

آبزی‌پروری شامل تکنیک‌هایی برای پرورش و برداشت آبزیان است که در تولید میگو به کار می‌رود. این صنعت در مناطقی که در آن اجرا می‌شود، منبع مهمی برای درآمدزایی و کسب ارز خارجی محسوب می‌شود. با این حال، شناسایی به‌موقع بیماری‌ها همچنان یکی از چالش‌های اساسی در تولیدات آبزی‌پروری و شیلات است.

در سال‌های اخیر، (EHP) Enterocytozoon hepatopenaei ، به عنوان یک عامل بیماری‌زای مهم در میگوی سفید اقیانوس آرام (Penaeus vannamei) در بسیاری از کشورهای آسیایی مانند ویتنام، چین، اندونزی، مالزی، تایلند، هند و کره شناسایی شده است. در آمریکای لاتین، این بیماری تاکنون تنها در ونزوئلا گزارش شده و در مکزیک موردی از آن ثبت نشده است. انتقال این بیماری از طریق تماس مستقیم بین میگوها از راه‌های دهانی یا مدفوعی، هم‌نوع‌خواری یا مواجهه با آب آلوده انجام می‌شود. بیماری هپاتوپانکراتیک میکروسپوریدیوز (HPM) عمدتاً با کاهش رشد و عفونت‌های شدید همراه است که می‌تواند به چرخه تولید ضعیف، افزایش تلفات و مشکلات در مراکز پرورش لارو منجر شود. این مطالعه مروری به بررسی اصلی‌ترین انگل‌های میکروسپوریدی و بیماری‌های مرتبط با میگوی سفید می‌پردازد و شامل نشانه‌های بالینی، روش‌های کنترل و پیشگیری از عفونت EHP  و  همچنین شناسایی HPM  با استفاده از تکنیک‌های مختلف است. برای تشخیص به‌موقع این بیماری‌ها، روش‌های مختلفی در دسترس هستند، از جمله میکروسکوپ نوری، میکروسکوپ الکترونی عبوری و تکنیک‌های بافت‌شناسی. با این حال، برای تشخیص دقیق‌تر، روش‌های مولکولی به دلیل حساسیت، اختصاصیت بالا و زمان کوتاه‌تر تحلیل، ارجحیت دارند. نتایج این بررسی نشان می‌دهد که پایش مستمر در مراکز تکثیر و مزارع پرورش میگو برای جلوگیری از ورود یا انتقال ارگانیسم‌های آلوده، امری ضروری است که بر تولید و توسعه مطلوب میگوهای سالم تأثیر مستقیم دارد.

مقدمه

میگوی سفید Penaeus vannamei  بومی سواحل اقیانوس آرام، از آمریکای مرکزی تا جنوب آمریکا است و به‌عنوان گونه غالب در صنعت پرورش میگو در سراسر جهان شناخته می‌شود، به‌طوری که بیش از ۹۹٪ تولید جهانی میگو را به خود اختصاص داده است. این میگو در مراحل اولیه زندگی خود، ناپلیوس (Nauplius) نامیده می‌شود و سپس به مراحل Protozoea, Mysis و Postlarva تبدیل می‌شود. از نظر ریخت‌شناسی خارجی، بدن میگوهای خانواده Penaeidae  کشیده و از طرفین فشرده است و به سه بخش اصلی تقسیم می‌شود: cephalothorax (سر و سینه)، pleon  (شکم) و telson (دم).  برخی از فعالیت‌های متابولیکی مرتبط با جذب و هضم مواد مغذی در هپاتوپانکراس (HP) انجام می‌شود. اهمیت این اندام از آنجا ناشی می‌شود که مطالعات اخیر نشان داده‌اند برخی از انگل‌هایی که در میگوهای وحشی و پرورشی وجود دارند، از طریق مصرف هپاتوپانکراس، غدد تناسلی یا بافت‌های آلوده میگو منتقل شده و باعث بروز بیماری‌ می‌شوند.

میکروسپوریدیوزیس بر عملکردهای حیاتی هپاتوپانکراس (HP) که شامل دفع، پوست‌اندازی، ذخیره انرژی، متابولیسم چربی و کربوهیدرات و فعالیت‌های متابولیکی متنوعی از جمله سنتز و ترشح آنزیم‌های گوارشی، جذب مواد مغذی، سنتز پروتئین‌های پلاسما و توانایی بالای خودترمیمی آن است تاثیر می‌گذارد.

میکروسپوریدیوزیس هپاتوپانکراس (HPM) ، که عامل بیماری‌زای آن (EHP) Enterocytozoon hepatopenaei  است، نمونه‌ای واضح از این بیماری‌های نوظهور می‌باشد. HPM برای اولین بار در سال 2009 در تایلند پیدا شد، جایی که هپاتوپانکراس‌های آتروفی‌شده ، روده‌های خالی، سوءتغذیه و تغییرات متعاقب در رشد در میگوها گزارش شد که باعث نوسانات در تولید و خسارات اقتصادی قابل‌توجه گردید. در سال 2016 اولین گزارش از این بیماری در آمریکای لاتین در ونزوئلا اعلام شد. یک بررسی کتابخانه‌ای برای بررسی علائم بالینی، اقدامات پیشگیری و تکنیک‌های تشخیصی برای عفونت EHP انجام شد. این تکنیک‌ها شامل تحلیل DNA با روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و qPCR (روش کمی)، میکروسکوپ نوری با رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ، میکروسکوپ الکترونی انتقالی (TEM) ، و تکنیک‌های هیبریداسیون درجا است. از آنجا که EHP یک مشکل نوظهور است که نیاز فوری به کنترل دارد، هدف این بررسی این است که نگاهی کلی به بیماری‌های اصلی ایجادشده توسط میکروسپوریدیا در میگوهای سفید و روش‌های فعلی استفاده‌ شده برای شناسایی HPM را ارائه دهد.

مهم‌ترین انگل‌ها در میگو

بسیاری از بیماری‌های میگو ناشی از وجود انگل‌هایی با منشاء حیوانی یا گیاهی است که برای رشد و تکامل به میزبان نیاز دارند. انگل‌ها می‌توانند بدون اینکه موجب بیماری یا مرگ شوند میزبان را آلوده کنند. پاتوژن‌های اصلی در میگوهای وحشی و پرورشی شامل gregarines، haplosporidians، epicommensals، metazoans و میکروسپوریدیا به همراه باکتری‌ها، ویروس‌ها، قارچ‌ها، پروتوزوآها، platyhelminthes و نماتودها هستند. Microsporidia انگل‌های داخل‌سلولی الزامی هستند که سلول‌های یوکاریوتی را آلوده می‌کنند. رشد این انگل‌ها معمولاً در سیتوپلاسم سلول میزبان از طریق تشکیل هاگ‌ها و تکثیر هسته‌ای صورت می‌گیرد. مسیر اصلی انتقال از طریق تماس با آب است و همچنین می‌تواند از طریق خوردن میگوهای دیگر یا انتقال از مولدین به لاروها صورت گیرد. برخی از ویژگی‌های اصلی پاتوژن میکروسپوریدیا در جدول 1 شرح داده شده است.

پیشگیری و کنترل بیماری‌های میگو

رعایت پروتکل‌های سخت‌گیرانه امنیت زیستی و مدیریت مناسب استخرها، مانند خشک کردن، شخم زدن، کلرزنی، تغییر رنگ آب و آهک‌پاشی برای جلوگیری از ابتلا به عفونت EHP از طریق آب و حامل‌های آبی ضروری است.

برای تغذیه میگو با حیوانات زنده، لازم است که قبل از استفاده، این مواد منجمد و پاستوریزه شوند تا از بروز بیماری‌های باکتریایی جلوگیری شود. انواع مختلفی از میکروارگانیسم‌ها عملکرد و ساختار هپاتوپانکراس (HP) را به دلیل حضور سلول‌های ضعیفی که در برابر حمله پاتوژن‌ها آسیب‌پذیر هستند، تخریب می‌کنند. برخی از بیماری‌هایی که بر HP تأثیر می‌گذارند در جدول 2 نشان داده شده است.

از دیدگاه اقتصادی، خانواده Enterocytozoonidae (رده Apansporoblastia، شاخه Microsporidia، سرشاخه Fungus) شامل دو گونه مهم میکرواسپوریدی است: Enterocytozoon bineusi و E. hepatopenaei که باعث خسارات اقتصادی قابل توجهی در تولید میگو به دلیل EHP می‌شود. این میکرواسپوریدیا میگوهای خانواده پنائیده مانند P. vannamei را آلوده کرده و بنابراین به‌عنوان تهدیدی برای پرورش آبزیان شناخته می‌شود. این انگل به اندام‌هایی مانند HP و روده میانی (midgut) حمله می‌کند و عمدتاً بر عملکرد جذب مواد مغذی تأثیر می‌گذارد.

مطالعات تجربی نشان داد که EHP یک عامل خطر برای نکروز حاد هپاتوپانکراس و سایر بیماری‌های احتمالی ناشی از پاتوژن‌های روده‌ای است. EHP با سندروم مدفوع سفید مرتبط بوده است. با این حال، مطالعات Tangprasittipap و همکاران (2013) گزارش کرده است که ارتباط بین عامل بیماری و پاتولوژی تایید نشده است (هنوز مشخص نشده که آیا این میکروارگانیسم -EHP- به طور مستقیم باعث بروز مشکلات و آسیب‌های خاص در میگو می‌شود یا خیر).

اگرچه مطالعاتی در زمینه تشخیص EHP وجود دارد، محدودیت اصلی در مطالعه EHP، مشکل در دسترس بودن مقادیر زیاد از مواد تلقیحی برای انجام مطالعات تجربی است. به همین دلیل، به‌دلیل عدم وجود روش‌های تکثیر in vitro مطالعات در مدت زمان کوتاه دشوار شده و تحقیقات ممکن است بهبود لاین های ژنی P. vannamei و تعیین مقاومت احتمالی در برابر EHP را به تأخیر بیاندازد.

بروز EHP

در سال 2004، اولین گزارش‌ها از حضور EHP در مزارع تایلند منتشر شد. در این گزارش‌ها یک میکرواسپوریدیوم سیتوپلاسمی جدید گزارش شد که تیوب های هپاتوانکراسی Penaeus monodon  را آلوده کرده و باعث سندرم رشد کند (SGS)  گردید. (Chayaburakul et al. 2004, Tang et al. 2015)  در سال 2002 صنعت میگو به شدت تحت تاثیر قرار گرفته بود و خسارات اقتصادی ناشی از این بیماری قابل توجه بود، تقریبا در حد 300 میلیون دلار آمریکا.

Tourtip و همکاران (2009) حضور اسپورهای بالغ را در هپاتوپانکراس P. monodon از طریق تحلیل فیلوژنتیکی گزارش کردند که نشان داد 84٪ شباهت به E. bineusi دارد. تکنیک‌های هیستوپاتولوژی و میکروسکوپ الکترونی انتقالی ویژگی‌های اولتراساختاری منحصر به فرد خانواده Enterocytozoonidae را به تصویر کشیدند. بنابراین، این عامل به عنوان یک گونه جدید به نام EHP شناخته شد. اسپورهای مشابه بعداً در چین، اندونزی، مالزی و ویتنام گزارش شدند که میگوی سفید P. vannamei را آلوده کرده بودند.

Tang و همکاران (2017) اولین مورد از EHP را در میگوی سفید پرورشی در ونزوئلا گزارش کردند. این مطالعه با استفاده از تکنیک‌های هیستوپاتولوژی، هیبریداسیون درجا و تحلیل مولکولی انجام شد. نتایج هیستوپاتولوژی بسیار شبیه به EHP از آسیای جنوب شرقی بود اما تحلیل مولکولی از نظر فیلوژنی درصدهای شباهت 99، 93 و 91٪ را نشان داد که حاکی از آن بود که EHP در ونزوئلا از آسیای جنوب شرقی وارد نشده است. همراه با  EHP، میگوهای سفید به سندرم Taura نیز آلوده شده بودند که تا سال 2005 در ونزوئلا گزارش نشده بود. ظهور EHP و سندرم Taura در صورت گسترش از طریق مسیرهای مختلف عفونت می‌تواند به تولید میگو آسیب برساند. کشورهای تایلند، چین، اندونزی، مالزی، ویتنام، هند، کره و ونزوئلا در حال حاضر از EHP آسیب دیده‌اند.

جدول 1-  ویژگی‌های اصلی Microsporidia  که میگوهای Penaeus. spp  را آلوده می‌کنند

(HP: هپاتوپانکراس، L: طول،W: عرض)

جدول 2- بیماری‌های اصلی که هپاتوپانکراس را تحت تأثیر قرار می‌دهند و مراحل زندگی حساس میگوهای Penaeus. spp  به آن

(ND : تعیین نشده، HP : هپاتوپانکراس)

چرخه زندگی EHP

چرخه زندگی Microsporidium  شامل سه مرحله است: Merogony که فاز تکثیر است، Sporogony یا فاز اسپور و در نهایت مرحله عفونی یا اسپور بالغ (تصویر-1). دو مرحله اول به‌صورت داخل‌سلولی در سلول‌های میزبان توسعه می‌یابند.

ویژگی‌های کلی این چرخه با بلع اسپورها آغاز می‌شود. فعال‌سازی اسپور با تزریق Sporoplasm  به داخل سیتوپلاسم سلول میزبان، از طریق دستگاه برون‌ریزی Polar tube  انجام شده و به‌صورت متوالی وارد فاز Merogony  می‌شود، که در آن Meronts تولید می‌شوند که در ادامه Sporonts  را تشکیل می‌دهند. این اسپورها هنگام تقسیم، Sporoblasts  را ایجاد می‌کنند که در نهایت به اسپورهای بالغ تبدیل می‌شوند. سلول‌های اپیتلیال آلوده درHP  متورم شده و در نهایت ترکیده و اسپورهای بالغ را آزاد می‌کنند که موجب خودعفونتی سایر سلول‌هایHP  یا انتشار اسپورهای بالغ به محیط از طریق مدفوع می‌شود؛ به این ترتیب، آن‌ها می‌توانند سایر میگوها را آلوده کنند.

اسپور به‌عنوان کانون اصلی عفونت در نظر گرفته می‌شود. این ساختار از سه لایه ضخیم تشکیل شده است: اگزواسپور (exospore)، اندواسپور (endospore)، و پلاسمالما (plasmalemma).

اگزواسپور اولین لایه است؛ این لایه الکترودنس (electrodense) است، زیرا دارای یک لایه متراکم از الکترون و پروتئین است و به‌طور کلی سطحی یکنواخت دارد. اندواسپور، لایه‌ای با تراکم الکترونی کمتر است، به همین دلیل الکترولوست (electrolucent) نامیده می‌شود. این لایه داخلی است و از آلفا-کیتین (alpha-chitin) و گلیکوپروتئین‌ها تشکیل شده است.

سومین لایه غشای پلاسمایی یا پلاسمالما است که در درون خود سیتوپلاسم یا اسپوروپلاسم (sporoplasm) را جای داده است. اسپوروپلاسم، ماده عفونی میکروسپوریدیا محسوب می‌شود و شامل هسته، ریبوزوم‌ها و اندامک تهاجمی یا دستگاه تزریق (extrusion apparatus) است. این دستگاه تزریق، شامل لوله قطبی (polar tube) است که در یک انتها توسط دیسک لنگری (anchoring disk) به اسپور متصل شده و دارای مجموعه‌ای از غشاها است.

اسپورهای میکروسپوریدیا تنها اسپورهایی هستند که لوله قطبی آن‌ها به دور هسته پیچیده شده است و بسته به گونه، ممکن است تا ۳۰ حلقه داشته باشد. این لوله قطبی مسئول تزریق انگل اسپور به درون سلول میزبان جدید است.  فرایند تزریق بسیار سریع است و شرایط مساعد برای آن متفاوت است. ازجمله شرایطی که می‌توانند عفونت را تسهیل کنند، تغییرات pH، دهیدراسیون و سپس آبگیری مجدد، پراکسید هیدروژن، تابش فرابنفش و جریان کلسیم هستند.

تصویر 1- چرخه زندگی میکروسپوریدیا

Figure 1. Microsporidia life cycle.

اسپورهای EHP به شکل بیضی بوده و اندازه آن‌ها تقریباً ۰.۷ تا ۱.۱ میکرومتر است. اسپورهای بالغ از دیواری الکترودنس تشکیل شده‌اند که حاوی یک هسته، یک واکوئل خلفی با پنج تا شش حلقه فیلامنت قطبی و یک دیسک لنگر است که به فیلامنت قطبی متصل می‌شود و برای تلقیح اسپوروپلاسم به سلول‌های میزبان جهت جوانه‌زنی استفاده می‌شود.

اجزای اصلی که اسپور را تشکیل می‌دهند عبارتند از: دیوار سخت متشکل از اگزواسپور و اندواسپور، فیلامنت قطبی، دیسک لنگر، پلی‌روپلاست، واکوئل خلفی، هسته و غشای پلاسمایی (تصویر- ۲).

مکانیزم بیماری‌زایی EHP

برخلاف دیگر میکروسپوریدیاها،EHP  به میزبان واسط نیاز ندارد. این ارگانیسم می‌تواند چرخه زندگی خود را در دستگاه گوارشی میگو تکمیل کند. انتقال آن به طور مستقیم از میگو به میگو از طریق راه‌های خوراکی و مدفوعی، خوردن هم‌جنس یا تماس با آب آلوده انجام می‌شود. تحقیقات  Tangو همکاران (2016) نشان داد که عفونت‌ها می‌توانند به تدریج با توسعه پرورش میگو ( روزهای پرورش)گسترش یابند.

EHP  در ناحیه سیتوپلاسمی سلول‌های اپیتلیال لوله‌های هپاتوپانکراس تکثیر می‌یابد. فیلامنت قطبی سلول‌های میزبان را تلقیح کرده و با استفاده از پروتئین دیواره سلولی EhSWP1 به گیرنده هپارین میگو متصل می‌شود.

اسپور مرحله عفونی EHP است که توسط یک دیواره احاطه شده است که به دو بخش اکسوسپور و اندوسپور تقسیم می‌شود و این ساختار مقاومت در برابر عوامل خارجی را فراهم می‌کند.

تصویر 2- نمایش گرافیکی از بخش‌های اصلی اسپور Enterocytozoon hepatopenaei.

علائم بالینی میکروسپوریدیوز هپاتوپانکراس (HPM)

میکروسپوریدیوز هپاتوپانکراس (HPM)، که عامل آن میکروسپوریدیوم EHP  است، با کندی رشد میگو و افزایش حساسیت به شیوع سایر بیماری‌ها، مانند سندرم تورا، نکروز حاد هپاتوپانکراس و سندرم مدفوع سفید شناخته می‌شود.

میگوهای آلوده علائمی مشابه عفونت‌های مزمن نشان می‌دهند. هپاتوپانکراس آن‌ها رنگ‌پریده و رشدنیافته است و روده‌هایشان خالی یا نامنظم به نظر می‌رسد. این وضعیت باعث ضعف ناشی از سوءتغذیه می‌شود و در نتیجه، آن‌ها در برابر عفونت‌های باکتریایی ناشی از گونه‌های Vibrio  آسیب‌پذیر شده و ممکن است تلف شوند.

کنترل میکروسپوریدیوز هپاتوپانکراس (HPM)

در حال حاضر، هیچ گزارش معتبری درباره درمان‌های مؤثر برای میکروسپوریدیوز هپاتوپانکراس (HPM) وجود ندارد. با این حال، برخی از پرورش‌دهندگان میگو به دلیل خواص ضدمیکروبی سیر، از خمیر سیر (۳۰ تا ۴۰ گرم در هر کیلوگرم غذا) به عنوان یک درمان جایگزین استفاده می‌کنند. در اندونزی، تولیدکنندگان ترکیبی از پروبیوتیک‌ها و خمیر سیر غنی‌شده با ویتامین C را به کار برده‌اند.

خواص ضدمیکروبی سیر از دوران باستان مورد مطالعه قرار گرفته است. تحقیقات نشان داده‌اند که عصاره خام سیر، به دلیل داشتن ترکیبات آنتی‌اکسیدانی اصلی مانند آلیل سیستئین، آلیین، آلیسین و آلیل دی‌سولفید، اثر ضدمیکروبی بر مخمرها، قارچ‌ها و طیف گسترده‌ای از میکروارگانیسم‌های گرم مثبت و گرم منفی دارد.

از جمله این باکتری‌ها می‌توان به Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, S. hemolyticus, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella enteritidis, Bacillus mycoides و Serratia marcescens اشاره کرد. ترکیبات موجود در سیر دارای گروه‌های آمینی هستند که می‌توانند با اجزای غشای سلولی میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا واکنش داده و منجر به تخریب سلولی و غیرفعال‌سازی آن‌ها شوند.

مطالعات دیگری نیز موفقیت‌هایی در مهار خروج فیلامنت قطبی از هاگ‌های خالص‌شده میکروسپوریدیوم نشان داده‌اند. پژوهش Aldama et al. (2018) نشان داد که پرمنگنات پتاسیم (KMnO₄) با غلظت ۱۵ پی‌پی‌ام به مدت ۱۵ دقیقه، کلر فعال با غلظت ۴۰ پی‌پی‌ام به مدت ۱۵ دقیقه، اتانول ۲۰٪ (v/v) به مدت ۱۵ دقیقه و فرمالین با غلظت ۲۰۰ پی‌پی‌ام به مدت ۲۴ ساعت، تقریباً ۱۰۰٪ از هاگ‌ها را غیرفعال کرده‌اند.

در حال حاضر، هیچ داروی مشخصی برای درمان EHP وجود ندارد؛ بنابراین، تشخیص زودهنگام تنها راهکار مؤثر برای جلوگیری از خسارات تولید است.

تشخیص میکروسپوریدیوز هپاتوپانکراس (HPM)

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

تکنیک‌های مولکولی مانند PCR،  RT-PCR و  qPCRبه دلیل حساسیت بالای خود، ابزارهای پرکاربردی برای شناسایی عوامل بیماری‌زا در میگو محسوب می‌شوند و در پروتکل‌های توصیه‌شده توسط سازمان جهانی بهداشت دام (OIE)  قرار دارند.

PCRبا هدف تولید چندین نسخه از ناحیه خاصی از DNA، از آنزیم Taq پلیمراز، پرایمرها، نوکلئوتیدها، بافر و کوفاکتورهای دیگر، ازجمله ترکیبات با خلوص بالا مانند آب، استفاده می‌کند. شرایط و نسبت این مواد بسته به هدف آزمایش متغیر است.

برای تشخیص EHP، آماده‌سازی نمونه یک مرحله حیاتی محسوب می‌شود. به‌منظور جلوگیری از نتایج منفی کاذب و تخمین کمتر از حد شدت عفونت، توصیه می‌شود که کل هپاتوپانکراس (HP) همگن‌سازی شود و سپس یک زیرنمونه برای استخراج الگوی  DNAجهت تحلیل‌های بعدی برداشته شود.

تاکنون روش‌های محدودی از  PCR  برای تشخیص EHP توصیف شده‌اند. PCR تک‌مرحله‌ای یک روش ساده و آسان است که دامنه تشخیص آن ۱۰۰۰ تا ۱۰,۰۰۰ نسخه در هر واکنش می‌باشد، اما حساسیت کافی برای شناسایی ارگانیسم‌های حامل عفونت را ندارد.

بااین‌حال، Tang و همکاران (2015) پرایمرهای F/R510EHP- را از ژن 18S rRNA در ژنوم EHP انتخاب کردند و آزمایش PCR را با DNA استخراج‌شده از میگوهای آلوده به EHP انجام دادند. نتایج نشان داد که این روش قادر به شناسایی EHP در میگوهای آلوده بوده است. همچنین، این پرایمرها با Pleistophora یک میکروسپوریدیوم مرتبط با بیماری میگوی پنبه‌ای و یک آمیب آلوده‌کننده آبشش‌های میگو واکنش نشان ندادند.

Kummari و همکاران (2018) مشاهده کردند که در نمونه‌های هپاتوپانکراس (HP) میگوی سفید جمع‌آوری‌شده از ۳۸ مزرعه مختلف، ۳۵ نمونه با استفاده از Nested PCR و پرایمرهای طراحی‌شده توسط Tang و همکاران (2015) ، با اندازه آمپلیکون 510 جفت باز، برای EHP مثبت بودند. میزان شیوع EHP در هند ۹۲.۵٪ گزارش شد.

Han و همکاران (2020) گزارش دادند که میگوهای جنوب شرق آسیا به دو عامل بیماری‌زای نوظهور، یعنی EHP و Vibrio parahaemolyticus (حامل توکسین‌هایpirA  و pirB مرتبط با بیماری نکروز حاد هپاتوپانکراس) آلوده شده‌اند. این مطالعه نشان داد که با استفاده از qPCR، حدود ۲۸٪ از ۶۰ نمونه مورد بررسی برای EHP مثبت بودند، درحالی‌که تنها ۲٪ از نمونه‌ها به بیماری نکروز حاد هپاتوپانکراس مبتلا بودند.

ژن‌های SSU-rRNA به‌طور گسترده به‌عنوان اهداف PCR برای شناسایی گونه‌ها و تشخیص بیماری‌ها استفاده شده‌اند. با اینکه روش‌های مبتنی بر PCR از دقت کافی برای شناسایی گونه‌ها برخوردار هستند، اما درصورتی‌که ژن انتخاب‌شده در گونه هدف شباهت زیادی با سایر ارگانیسم‌های نزدیک به آن داشته باشد، ممکن است تفسیر نادرستی رخ دهد.

بااین‌حال، مطالعه‌ای مقایسه‌ای توسطJaroenlak  و همکاران (2016) برای بررسی اینکه آیا پرایمرهای EHP SSU-rRNA می‌توانند نواحی مشابه را از سایر میکروسپوریدیوم‌های نزدیک تقویت کنند، نشان داد که این نواحی به ‌شدت حفاظت‌شده هستند. توالی‌ها ۶۷ تا ۹۰ درصد شباهت به سایر میکروسپوریدیا داشتند که نشان می‌دهد این شباهت می‌تواند منجر به نتایج مثبت کاذب شود.

اگرچه پرایمرهای SSU-rRNA به‌طور مؤثر برای تشخیص سایر بیماری‌ها در میگو استفاده شده‌اند، ممکن است به‌عنوان جایگزین مناسبی برای تشخیص EHP نباشند. توصیه می‌شود که یک روش PCR تشخیصی تفکیک‌پذیر توسعه یابد.

Jaroenlak et al. (2016) از توالی ژن پروتئین دیواره هاگ (SWP) برای تشخیص EHP استفاده کردند. این روش نشان داد که شباهت کمتری بین توالی‌ها وجود دارد، که نشان می‌دهد آمپلیکون‌های نواحی SWP بهتر می‌توانند EHP را از سایر میکروسپوریدیا در آزمایش‌های PCR تفکیک کنند.

حد آستانه تشخیص پروتکل‌های طراحی‌شده برای EHP ده نسخه در هر واکنش است و این روش همچنین یک روش نیمه‌کمی نیز می‌باشد. با این‌حال، این روش‌ها نیاز به آموزش مناسب، آماده‌سازی صحیح نمونه، تجهیزات و زمان واکنش دارند. یک روش سریع مانند RPA زمان واقعی با ویژگی‌های خاصیت تشخیص بالا، سادگی و قابلیت اطمینان برای تشخیص EHP در مناطق دورافتاده مناسب خواهد بود.

Ma و همکاران (2021) آزمایشی مقایسه‌ای از RPA زمان واقعی برای تشخیص EHP با روش Nested-PCR پیشنهاد شده توسط Jaroenlak و همکاران (2016) انجام دادند. این آزمایش سرعت (۳-۷ دقیقه)، روش ساده و حساسیت تشخیصی مشابه با روش Nested PCR را گزارش کرد. حد تشخیص در ۹۵٪ از موارد ۱۳ نسخه در هر واکنش بود.

در مقایسه با روش PCR تک‌مرحله‌ای (جدول ۳)، روش Nested-PCR پیچیده‌تر است و از دو مجموعه پرایمر استفاده می‌کند، اما حساسیت آن ده برابر بیشتر است و قادر به شناسایی سطوح پایین عفونت می‌باشد. روش‌های گزارش‌شده از حساسیت بالایی برای تشخیص EHP برخوردارند. با این حال، انتخاب روش به‌ عنوان ابزار تشخیصی بستگی به شرایط و منابع موجود برای تجزیه و تحلیل مناسب دارد.

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

این ابزار تشخیص پاتوژن‌های مختلف را ممکن می‌سازد و ویژگی‌های فوق ساختاری را می‌توان بر روی یک صفحه فلوروسنت از طریق شیشه حفاظتی سربی مشاهده کرد. این فناوری امکان مشاهده و توصیف ارگانل‌ها را فراهم می‌کند و پیگیری مراحل مختلف میکروسپوریدیوم را ممکن می‌سازد. نویسندگان مختلف توانسته‌اند از این روش برای توصیف اسپورهای EHP استفاده کنند.

Tourtip  و همکاران (2009) ساختار فوق‌العاده EHP را از طریق TEM مشاهده کردند، زیرا میکروگراف مراحل مختلف میکروسپوریدیوم را در سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیالی لوله‌های HP نشان داد. اگرچه مراحل اولیه مرونت‌ها مشاهده نشد، مراحل اولیه و نهایی اسپوروگونی، که ویژگی اعضای خانواده Enterocytozoonidae است، مشاهده شد.

با استفاده از TEM، Cruz-Flores و همکاران (2019) اسپورهای EHP را در نمونه‌های بیوپسی HP شناسایی کردند. اسپورهای مشاهده شده عرضی به اندازه 1.0 ± 0.8 میکرومتر و طولی برابر با 0.7 ± 0.4 میکرومتر داشتند.

هیستوپاتولوژی

این یک ابزار تشخیصی است که تغییرات در سطح سلولی را از طریق برش‌های بافتی که تحت یک سری از فرآیندهای فیزیکی و رنگ‌آمیزی خاص قرار می‌گیرند شناسایی می‌کند.

متدولوژی Bell & Lightner 1988 پیشنهاد می‌کند که ارگانیسم‌ها در محلول الکل-فرمالین-اسید استیک داویدسون ثابت شوند. این اعمال باید بلافاصله پس از مرگ حیوان انجام شود. برای حفظ ارگانیسم در شرایط دقیق مرگ آن، این فرآیند شامل برش‌ها، خشکی با الکل، پارافین‌گذاری، برش‌های میکروتومی و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) است.

از طریق این تکنیک تشخیصی، می‌توان اسپورهای EHP را که سلول‌های اپی‌تلیالی HP را آلوده می‌کنند مشاهده کرد. در مطالعه Tourtip و همکاران (2009)، مقاطع هیستولوژیک HP مراحل مختلفی از توسعه EHP را نشان داد که با رنگ‌آمیزی درون‌سیتوپلاسمی مشخص شد. علاوه بر این، آن‌ها اسپورهای بالغ را مشاهده کردند که با اسپورهای مشاهده شده در TEM تطابق داشت. Tang و همکاران (2015) در آزمایشات هیستولوژیک خود از HPهای P. vannamei، درون‌گنجایش‌های بازیوفیلیک را در سیتوپلاسم سلول‌های اپی‌تلیالی لوله‌های هپاتوانکریاتیک و اسپورهای بالغ نشان دادند.

جدول 3- پرایمرهای اختصاصی برای شناسایی   Enterocytozoon hepatopenaei

هیبریداسیون در جا  (ISH)

هیبریداسیون درجا (ISH)  ابزاری است که برای تعیین موقعیت اسید نوکلئیک پاتوژن در مقاطع بافتی حیوانی که آزمایش PCR  آن‌ها مثبت بوده است، استفاده می‌شود. این روش از پروب‌های اولیگونوکلئوتیدی نشاندار با فلوروکرم استفاده می‌کند که توالی‌های خاص rRNA را هدف قرار می‌دهند و امکان شناسایی سریع و اختصاصی سلول‌های میکروبی را فراهم می‌آورد. با این حال، توصیه می‌شود که روش‌های دیگر این روش را تکمیل کنند.

مطالعه Tang و همکاران (2015) نشان داد که Penaeus stylirostris و P. monodon با استفاده از تکنیک‌های هیستولوژی و هیبریداسیون در محل به EHP آلوده شده‌اند؛ اما نمونه‌هایی که در آن‌ها اسپور توسط هیستولوژی شناسایی نشده بود، توسط ISH  مثبت شناخته شدند. بنابراین،ISH  حساسیت بالاتری در شناسایی پاتوژن‌ها دارد.

Biju و همکاران (2016) هیبریداسیون مثبت را در مقاطع پارالل سلول‌های HP در مقاطع هیستولوژیک مشاهده کردند و دریافتند که 32% از میگوهای مثبت به EHP، عفونت باکتریایی همراه با گونه‌های ویبریو داشتند که به عنوان نکروز هپاتوانکریاتیک سپتیک توصیف می‌شود.

پرورش میگوی سفید بیش از 50 درصد تولید سخت پوستان آبزی در جهان را تشکیل می‌دهد. اگرچه کشورهای آسیایی تولید جهانی این گونه و سایر گونه‌ها را غالباً در دست دارند، کشورهای آمریکای لاتین مانند اکوادور، برزیل و مکزیک شرایط طبیعی لازم برای تبدیل شدن به پیشتازان در پرورش میگو را دارند.

اگرچه به نظر نمی‌رسد که EHP باعث مرگ و میر بالایی در پرورش P. vannamei شود، اما یک تهدید نهفته و بحرانی است. علائم عفونت مستقیماً بر توسعه میگو تأثیر می‌گذارد و با تأخیر رشد شدید و احتمال عفونت‌های همزمان با پاتوژن‌های دیگر منعکس می‌شود. با استفاده از ابزارهای تشخیصی مناسب و برنامه‌های نظارتی برای پیشگیری از EHP، می‌توان پرورش میگوی سالم و پایدار را کنترل و تضمین کرد.

زمانی که میگوها هیچ علائم بالینی نشان نمی‌دهند، EHP عمدتاً با دو روش تشخیص داده می‌شود. اولین روش تجزیه و تحلیل DNA با PCR و qPCR است که ابزار استاندارد طلایی برای تشخیص بسیاری از بیماری‌های میگو است. دومین روش، شناسایی اسپورها با میکروسکوپ و رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین (هیستولوژی)، میکروسکوپ الکترونی اسکن، میکروسکوپ الکترونی عبوری و تکنیک‌های هیبریداسیون در محل با پروب نشاندار دیوگوسیژنین است (روش‌های کیفی).

در این مطالعه، مقایسه‌ای از تکنیک‌های تشخیصی نشان می‌دهد که تنها عفونت شدید توسط EHP حضور اسپورها را در یک خراش از HP نشان می‌دهد. در مقابل، عفونت خفیف تنها با استفاده از میکروسکوپی به عنوان ابزار تشخیص قابل شناسایی نیست. از طرف دیگر، ویژگی‌های هیستوپاتولوژیک عفونت EHP قابل مشاهده است که شامل حضور مراحل مختلف میکرواسپوریدیا در سلول‌های اپی‌تلیالی لوله‌های HP و همچنین اسپورهای آزاد از سلول‌های اپی‌تلیالی پاره شده یا جدا شده است Tourtip. و همکاران (2009)، Tangprasittipap و همکاران (2013) و Tang و همکاران (2015) دریافتند که این یافته‌ها می‌تواند با استفاده از متدولوژی Bell & Lightner (1988) و رنگ‌آمیزی استاندارد H&E مشاهده شود. با این حال، مراحل اولیه و اسپورها بسیار کوچک هستند و برای تشخیص آن‌ها از محتوای سلول‌های میزبان طبیعی بدون روش‌های رنگ‌آمیزی خاص، به لنز غوطه‌وری در روغن نیاز است، به‌ویژه در علائم عفونت با سطح پایین. برای اطمینان از تشخیص عفونت EHP، توصیه می‌شود که تکنیک‌های مولکولی و بررسی‌های هیستولوژیک انجام شود.

نتیجه‌گیری

بیماریHPM  از طریق مصرف بافت‌های آلوده، بلع مواد دفعی یا قرار گرفتن در معرض آب آلوده منتقل می‌شود. در نتیجه، عملکردهای حیات هپاتوپانکراس تحت تأثیر قرار می‌گیرند.EHP  یک بیماری نوظهور است که می‌تواند زیان‌های اقتصادی قابل توجهی به صنعت آبزی‌پروری وارد کند. بنابراین توصیه می‌شود که نهادهای بهداشتی، پروتکل‌های سخت‌گیرانه امنیت زیستی و برنامه‌های پایش را اجرا کنند تا از بروز این بیماری در کشورهایی که تاکنون EHP  در آن‌ها مشاهده نشده است جلوگیری شود.

از آنجا که تاکنون هیچ درمانی برای مقابله باHPM  وجود ندارد، توصیه می‌شود که از روش‌های مولکولی مانندPCR  برای تشخیص این پاتوژن‌ها در میگو استفاده شود، زیرا این روش‌ها از حساسیت بالایی برخوردار هستند. با توجه به شباهت زیاد نواحی همولوگ مورد تکثیر (67-90%) با سایر گونه‌های میکروسپوریدیا، استفاده از پرایمرهای اختصاصی که احتمال نتایج مثبت کاذب را کاهش می‌دهند، توصیه می‌شود.

تعداد بازدید: ۱۲
لینک کوتاه: کپی کن!
اشتراک گذاری

کلمه مورد نظرتان را جستجو کنید و یا با دکمه ESC خارج شوید